DNA纯化及杂质去除

酚类杂质的去除

       对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。在提取DNA 过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。

       在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。

       因此在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度) ,其用量视杂质的多少而定(1 %～6 %) ,PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。

       在CTAB 缓冲液加入一定量的硼砂(提取缓冲液含0. 012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB 、 1. 4 mol/ L NaCl 、巯基乙醇0. 1 mol/ L ,pH值为9. 0) 提取柽柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA 时也从未发生褐化。

多糖类杂质的去除

       多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题 。植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。

       近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta 等认为加入高浓度的 KAc 有利于除去多糖 ;Fang 等认为在1. 0～2. 5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖 ;

        Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖;Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖 ;

       徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 ℃放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质 ;

       陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含 CTAB 的提取缓冲液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ Lβ2巯基乙醇) 去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的 ;

       程运江等先用水饱、乙醚和1. 2～1. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率。

       An Michiels 等用生长2～4 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 ℃异丙醇过夜沉淀DNA 能减少杂质污染且大大提高产率 。

       关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响pcr 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。

       但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切。目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1. 8～2. 0 表明 DNA 的纯度较好。

       尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠, 因为核酸在260 nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2 个波长下吸收值的比值发生明显改变 。

       检测DNA 纯度最佳的办法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸内切酶对DNA 进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因组DNA ,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AFLP、RFLP、Southern 杂交等分子生物学的研究。

       （本文转载生物秀）