1 入无菌室之前首先要用肥皂或洗手液洗手，用新洁尔灭溶液擦拭双手消毒。

2 打开超净工作台的紫外消毒灯（紫外消毒20-30min）。从CO2培养箱取出培养细胞，倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置于37℃下预热。

3 关闭已照射超净工作台20min左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

4 点燃酒精灯，用75%乙醇擦拭双手消毒，并擦净台面。

5 将培养用液瓶身用75%酒精檫拭消毒后放入操作台内。

6 从培养箱中取出细胞培养瓶，经75%酒精喷洒消毒后立放于操作台内。

7 倒掉细胞旧培养液，4ml PBS洗涤两遍，解除残留血清对胰蛋白酶的抑制作用。

8 向培养瓶（25cm2）加入1ml的胰酶消化液，小瓶用量酬减。

9 盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，立刻放入培养箱中消化，一般1-2min。

10 当细胞突起收回即将变圆时立即取出。

11 加入5ml含血清的新鲜培养基，反复吹打贴壁细胞的培养瓶底部使消化好的细胞脱壁并分散，移入10ml离心管中，800 r/min，2min。

12 加入1-2ml培养基制成细胞悬液并计数。根据计数结果，按每个小方瓶2×105接种细胞传代培养。

13 盖上瓶盖，适度柠紧后再稍旋回，给出空气通道，以利于CO2气体的进出，将培养瓶放回培养箱。