分子平台
一. 服务介绍
目的:
对RNasin性能效果进行检测及评估。
二.实验材料以及设备
模板RNA:大鼠肌肉组织RNA检测
引物:Rat β-acting:Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC
Reverse TTTAATGTCACGCACGATTTC
RNase:50mg/ml(simgen)
RNasin:40U/µl
cDNA第一链合成试剂盒(simgen)、2×SYBR Green PCR mix(simgen)
设备:
ABI 7000 荧光PCR仪、普通PCR仪、离心机及移液器
其他耗材:
0.6ml离心管,八连排管,RNase-free吸头,一次性手套及防护用品和纸巾。
三.实验方法:
利用逆转录反应将RNA逆转录成cDNA及SYBR Green荧光PCR方法对RNasin产品的性能效果进行检测评估。
设计思路:
1. 编号1-4为测试同一批RNasin的性能,1号与3号是测试相同RNA量和RNase量,加不加RNasin对cDNA合成的影响,即RNasin抑制RNase的活性效果。
2. 4号是表示在不添加RNase和RNasin时的空白对照。
实验步骤:
表1 gDNA去除反应体系
表1 gDNA去除反应体系
试剂编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5×gDNA Buffer(µl) |
2 |
2 |
2 |
2 |
RNA(µl)*1 |
4 |
4 |
4 |
4 |
RNase(ng)*2 |
2 |
20 |
2 |
— |
RNasin(µl)*3 |
— |
2 |
2 |
— |
RNA-Free H2O(µl) |
补足到10µl
|
注:
2. RNase的浓度分别为1ng/µl和10ng/µl,故在加入RNase时均加入2µl,保证不同的量相同体积,以减少误差,在加RNase的时候应尽量在无RNase的环境中添加,以免环境中RNase过多而导致RNA降解严重从而在荧光PCR上反映不出差异。
3. RNasin的浓度为40U/µl,添加RNasin应在加RNA之前添加。后续cDNA合成步骤参考cDNA第一链合成试剂盒(simgen)说明书操作。所得cDNA稀释5倍,置于冰上备用。
荧光PCR步骤参考2×SYBR Green PCR Mix(simgen)说明书操作。
将稀释好的cDNA模板按照5µl/管加入到荧光PCR反应体系混合液中,进行荧光PCR扩增,观察实验结果。
(本文转载丁香园)
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