目的:应用 Tet-On 基因表达调控系统构建 Alb 启动子调控小型猪 uPA (pig urokinase-type-plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体 pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)｡

方法:首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以 pCD823A-1为模板,PCR 扩增 T2A-CopGFP,In-Fusion 克隆至 BamH I/Age I 酶切的 pLVX-Alb-TetOne 中,获得 pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以 H8803 为模板,PCR 扩增 puPA(3′端含 Flag 标签),InFusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG);所构建 的质粒均经酶切和测序鉴定｡ pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔 板内加入强力霉素(Dox),48h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提 总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Westernblot检测Flag表达｡

结果:酶切鉴定和 测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG｡ pLATTPUTG转染293T细胞,24h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧 光,而加入Dox48h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞 上puPA､CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提 示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达｡

结论:成功基于Tet-On基 因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实 基础｡